于和伟于上世纪七十年代出生于辽宁省抚顺市，是母亲在四十五岁时生下的孩子。他在家中排行最小，前面共有八位哥哥姐姐。由于子女众多，家庭经济条件一直较为拮据。自幼年起，于和伟便得到了兄长姐姐们无微不至的关怀与照料。三岁那年，他的父亲不幸离世，此后他便由母亲和长姐共同承担起抚养责任。于和伟从小便展现出对文艺活动的浓厚兴趣，初中毕业后，他进入抚顺市幼儿师范学校中专部音乐班学习。三年学业完成后，他顺利考入抚顺话剧团，开始了最初的舞台实践。在长姐的全力支持下，1992年，时年二十一岁的于和伟成功考取了上海戏剧学院，踏上了专业学习的道路。作为一名来自北方的青年，初到上海的他一度感到诸多不适。一方面，考入高等艺术学府带来的成就感让他振奋；另一方面，远离东北故乡也让他心中萦绕着强烈的思乡之情。更为坎坷的是，入学第一天他便遭遇了行李遗失的意外。幸而在高年级同乡学长的热心帮助下，于和伟才得以安然度过开学初那段艰难时光。经过一个学期的磨合，他逐渐适应了大学的生活节奏，并与许多同学建立了深厚的友谊。在校期间，于和伟不仅刻苦钻研专业表演知识与技能，还利用课余时间从事兼职工作，以补贴自己的学费开支。大学三年级排练毕业实习大戏时，在表演课教师李学通的推荐下，他获得了在话剧《打野鸭》中饰演主角齐洛夫的机会。此外，他还与同班同学共同参演了由范益松老师翻译的首个中文版话剧《借我一个男高音》。该剧于上海商城剧场公开演出，现场众多外籍观众被其真挚表演所深深打动。1996年自上海戏剧学院毕业后，于和伟被分配至南京军区政治部前线话剧团，成为一名军队文艺工作者。然而在刚进入话剧团的时期，他的事业发展并不顺利，往往只能担任一些戏份极少的配角，甚至跑龙套的角色。在最为困顿的阶段，他曾接过仅演出一天、报酬仅二百元的角色，正是妻子始终如一的理解与默默支持，支撑着他在这条演艺道路上坚持前行，未曾放弃。
一九九九年，于和伟通过参演个人首部古装剧《曹操》正式踏入演艺圈，他在剧中塑造了谋士荀彧的形象，由此开启了自己的表演生涯。两年后，他出现在都市喜剧《王记大排档》中，生动演绎了厨师西瓜这一角色，进一步积累了表演经验。二零零三年，得益于他在南京军区三位老师的鼎力推荐——这三位老师恰巧都是《历史的天空》的编剧——于和伟获得了与导演高希希合作的机会，在剧中出演了自私卑鄙的反派万古碑。尽管与其他角色动辄数百场戏份相比，于和伟所饰演的万古碑仅有九十余场戏，发挥空间相对有限，但他并未因此松懈，而是反复钻研剧本、揣摩人物心理，最终将这一反面角色的复杂性与阴暗面展现得淋漓尽致。随着该剧的热播，于和伟的姓名也逐渐为广大观众所熟知。同年，他还在近代传奇剧《大宅门2》中饰演了白景琦的孙子白占安，进一步拓宽了戏路。“万古碑”一角的成功，在相当一段时间内为于和伟奠定了擅长刻画反面人物的表演路径。此后他继续与高希希导演保持密切合作，例如在二零零五年，他先后出演了都市情感剧《岁月》中的吴过，以及情感伦理剧《搭错车》中的苏民生等具有反面特质的角色。尤其是在《岁月》里，他将小公务员吴过那种色厉内荏、既可悲又可厌的形象刻画得入木三分，令观众印象深刻。在谈及饰演反派的经验时，于和伟曾特别指出，演员绝不能先入为主地对角色产生厌恶情绪；即便全世界都视这个人物为坏人，演员自身也不能简单地以“坏人”标签去理解他，而必须深入其内心世界，把握行为背后的动机与逻辑，进而通过细腻的表情和准确的行为举止，真实而鲜活地呈现出角色的复杂面貌。在那段时期，于和伟不仅与高希希导演频繁合作，也持续参与了多部由南京军区主导创作的军旅题材剧集的演出，不断磨练自己的演技。
二零零六年，演员于和伟与侯勇、殷桃等共同主演的都市情感剧《真情年代》正式与观众见面，他在剧中生动塑造了一位循规蹈矩的知识分子形象——李和平。同年，他还与喜剧演员吴君如携手合作，参与了喜剧作品《我爱芙蓉姐》的演出；此后不久，他与许晴、殷桃等联袂出演的都市商战题材剧集《局中局》也登陆荧屏，于和伟在剧中一人分饰两角，既扮演了广告公司总经理常青，又诠释了大博金董事长赵天宇及其孪生哥哥周英文这两个截然不同的角色，展现出其深厚的表演功力。进入二零零七年，于和伟继续活跃于电视荧幕，先后出演了由高希希导演执导的伦理情感剧《男人底线》以及一部描绘革命岁月的年代剧《光荣岁月》；同年，他还担纲主演了一部刑侦题材剧集《华容道》，在剧中成功塑造了南华老板郭林这一复杂角色。二零零八年，于和伟参演的抗战题材电视剧《霓虹灯下的哨兵》播出，他在剧中饰演了前线文工团演员郝铁；同年十一月二十二日，他出演的一部爱情剧《纸醉金迷》与观众见面，于和伟在剧中将奸商范宝华的形象刻画得入木三分，并凭借这一角色的出色演绎，获得了第十五届上海电视节白玉兰奖最佳男演员奖的提名；次日，即十一月二十三日，他与马伊琍合作主演的都市情感剧《锁春记》播出，于和伟在剧中扮演了金融界精英庄世博，展现了其驾驭现代职场人物的能力；两天后的十一月二十五日，他与梅婷、姜洪波、沙溢一同主演的情感剧《漂亮的事》也如期播出，进一步丰富了其表演履历。二零零九年，于和伟在郑方南执导的军旅爱情剧《战地浪漫曲》中，饰演了心地善良的唐副司令一角。二零一零年，于和伟出演的都市悬疑剧《面具》播出，他在剧中饰演了著名的精神心理学博士常思远；同年五月二日，他与陈建斌、陆毅、倪大红等实力派演员合作主演的大型古装剧《三国》隆重开播，于和伟在剧中饰演了三国时期蜀汉的开国皇帝刘备，并倾情演唱了该剧的主题曲《短歌行》。该剧播出期间取得了极高的收视成绩，平均收视率稳定在百分之一点三，并连续四十八天保持四个播出平台的总收视率超过百分之四，成功摘得年度古装剧收视冠军的桂冠，同时也收获了观众的一致好评，于和伟也凭借对刘备这一历史人物的精彩演绎，获得了广泛的认可与赞誉。同年七月，他与胡军、梅婷合作出演的都市情感剧《岁月》在北京卫视播出，他在剧中饰演了性格善良的现代机关干部吴过；九月六日，他主演的年代战争剧《家仇》在东方卫视播出，于和伟在剧中成功塑造了个性冷静、凶残多变且老谋深算的军阀张天心；九月二十日，由南京军区前线文工团精心打造的年代军事动作大戏《特战先锋》正式开播，于和伟在剧中饰演了军统局头子毛人凤；十月二十日，其参演的近代革命剧《冰是睡着的水》播出，他在剧中饰演了特工周新宇；十二月，他与林永健、何赛飞共同主演的都市情感剧《老马家的幸福往事》播出，他在剧中饰演了莫文辉一角；同年，他还与罗海琼搭档主演了都市情感剧《幸福在路上》，于和伟在剧中饰演了军分区参谋马刚，并凭借这一角色荣获了南方盛典最佳男演员奖，这无疑是对其表演事业的又一次重要肯定。二零一一年五月十六日，他搭档谷智鑫、李沁、徐百慧等人合作主演的近代革命剧《中国1921》播出，于和伟在剧中饰演了曾任北京大学文科学长的陈独秀，展现了其驾驭历史人物的能力；同年十一月十四日，他主演的谍战剧《兵临城下》上星播出，于和伟在剧中饰演了主角杨少诚，再次以扎实的演技赢得了观众的关注。
二零一二年二月二十九日，为配合谍战剧《青盲》的宣传造势，于和伟与沙溢等主要创作人员共同作为嘉宾参与录制的娱乐访谈节目《非常静距离》正式播出；紧接着在次月，由他担纲主演的一部年代谍战剧《青盲》也与观众见面，他在剧中精彩诠释了庆军需处中校副处长张海峰这一角色；同年六月二十五日，一部都市情感剧《男人的战争》登陆荧屏，于和伟在剧中扮演了冶金大院三兄弟中的大哥唐季山；七月十五日，他与佟瑞欣、赵恒煊、海顿等演员联袂主演的谍战题材作品《奸细》于山东电视台影视频道首播，他所饰演的军统关州总负责人江一平给观众留下了深刻印象；八月十三日，一部聚焦家庭情感的作品《大家庭》在中央电视台综合频道播出，于和伟在剧中生动塑造了回城知青袁刚的形象；十月一日，其参演的军旅题材剧集《我是特种兵之利刃出鞘》播出，他饰演了团长康雷一角；十月二十二日，与王丽坤合作主演的抗战剧《连环套》亮相，他在剧中扮演了中共地下党员孟庆凡；十二月十八日，于和伟与潘虹、刘涛等人共同主演的家庭伦理剧《天下人家》播出，他饰演了一位在殡仪馆工作的化妆师唐中秋；十二月二十八日，其参演的古装武侠剧《楚汉传奇》播出，他在剧中挑战了中国历史上第一位皇帝秦始皇的角色。时间来到二零一三年七月二十二日，于和伟与何晟铭、白冰共同主演的家庭爱情剧《婚前协议》播出，他饰演了时装设计公司的董事长高寒；同年十二月十五日，他与王丽坤再度搭档主演的抗战剧《零下三十八度》播出，于和伟在剧中成功塑造了诈死后隐居的国民党特工年定邦。二零一四年四月二十八日，于和伟又一次与王丽坤合作，主演的都市时尚情感剧《爱的多米诺》播出，他在剧中饰演了戴谷顺；八月十四日，于和伟与刘涛等演员联袂主演的都市情感剧《下一站婚姻》播出，他饰演了转业特种兵龚箭，正是凭借这一深入人心的角色，于和伟荣获了第17届华鼎奖当代题材最佳男演员奖。二零一五年，刑侦题材剧集在卫视黄金档得以解禁播出。同年五月，于和伟主演了一部刑侦剧《刑警队长》，他在剧中饰演了刑警队长顾铭，该剧是根据真实人物事迹改编而成。在正式开拍之前，于和伟特意前往人物原型顾瑛生前所在的南通刑警支队，进行了为期半个月的深入生活体验，并与顾瑛生前的战友和亲属进行了细致的交流。正是通过塑造这一英雄角色，于和伟在当代题材剧集中诠释正面人物的戏路被彻底打开；十二月二十四日，他与冯小刚、许晴主演的剧情动作片《老炮儿》上映，于和伟在片中饰演了性格既温柔又霸气的龚叔。二零一六年一月十五日，于和伟与黄渤、孙红雷、黄磊等众多实力派演员合作主演的喜剧电影《极限挑战之皇家宝藏》上映，他在片中饰演了明朝的永历帝；二月，在一部贺岁片《过年好》中，他饰演了沈强一角；五月十五日，与朱雨辰、李小冉共同出演的年代谍战剧《追击者》播出，他在剧中扮演了军统特工曹若飞；七月二十二日，其出演的悬疑电影《魔都凶音》上映；同月，他与李坤主演的神犬励志剧《警花与警犬》在浙江卫视播出后，连续多日蝉联卫视收视冠军；十一月十八日，参演由冯小刚执导的电影《我不是潘金莲》上映，他在片中饰演新任县长郑重，并凭借这一角色获得了第31届中国电影金鸡奖最佳男配角奖。二零一七年六月，于和伟主演的古装权谋剧《大军师司马懿之军师联盟》播出，他在剧中精彩演绎了枭雄曹操，凭借对这一历史人物的出色诠释，于和伟成功斩获第24届上海电视节“白玉兰奖”最佳男配角奖，并荣获2017年度新锐榜“年度艺人”称号；七月二十七日，其出演的革命史诗电影《建军大业》上映，于和伟在片中再度饰演了陈独秀这一重要历史人物；十一月二十八日，其参与录制的阅读推广季播节目《见字如面第二季》在黑龙江卫视播出；十二月，他与刘欢及叶璇联袂主演的抗战剧《搜索连》播出，在剧中饰演了师长吴休葆。二零一八年对于和伟而言是收获颇丰的一年，他不仅出演了多部电视剧，还参演了三部大银幕作品，其录制的综艺节目也相继播出，并获得了多个重要奖项的肯定。四月四日，于和伟凭借在电视剧《刑警队长》和《大军师司马懿之军师联盟》中的出色表现，成功入围第31届中国电视剧飞天奖优秀男演员奖；四月十六日，其主演的都市情感轻喜剧《下一站，别离》播出，他在剧中饰演了公司高管秋阳；该剧的插曲《青春告别诗》也由于和伟亲自献唱；四月二十八日，其参演的犯罪悬疑片《幕后玩家》上映；五月十八日，他出演了由徐峥监制的爱情喜剧片《超时空同居》，饰演了一位能够操控时空、让人回到过去的博士；六月，他以飞行嘉宾的身份参加了湖南卫视的生活服务纪实节目《向往的生活第二季》；七月六日，于和伟领衔主演的刑侦缉毒剧《猎毒人》播出，他在剧中饰演了高智商、高学历的化学工程师吕云鹏；七月二十日，其参演的探险题材电视剧《沙海》播出，他在剧中饰演了吴邪的三叔吴三省；八月十日，其与黄渤、张艺兴共同出演的喜剧片《一出好戏》上映；九月，其作为飞行导师参加的演技竞演类励志综艺节目《我就是演员》播出；十月十四日，凭借在电视剧《大军师司马懿之军师联盟》中的精湛表演，于和伟获得中国电视金鹰奖观众喜爱的男演员奖提名。二零一九年二月五日，于和伟参演的喜剧片《疯狂的外星人》播出；三月五日，他参加了由SMG和东方卫视联合主办的2019中国电视剧品质盛典，并荣获“年度实力演技剧星”称号；四月八日，其出演的神话剧《封神演义》播出，于和伟在剧中饰演了周朝的开国丞相姜子牙；九月七日，他获得了第十七届电影表演艺术学会奖；十二月三十一日，其主演的爱情喜剧片《宠爱》上映，在片中饰演了高铭。二零二零年十月一日，于和伟参演的主旋律电影《我和我的家乡》上映，其在片中饰演了姜伟岸；十二月十三日，其主演的检察题材剧集《巡回检察组》播出，他在剧中饰演了东川省巡回检察组组长冯森；该剧后来荣获了第33届电视剧飞天奖“优秀电视剧奖”。二零二一年一月九日，于和伟与章子怡、周一围搭档主演的古装历史剧《上阳赋》播出，他在剧中饰演了王儇的父亲王蔺；二月一日，与张桐、侯京健主演的近代革命剧《觉醒年代》播出，于和伟在剧中第三次饰演陈独秀，并凭借此剧荣获第27届上海电视节白玉兰奖最佳男主角奖；二月十二日，与雷佳音、杨幂、董子健合作主演的悬疑片《刺杀小说家》上映，其饰演了李沐一角；四月三十日，出演张艺谋执导的谍战题材电影《悬崖之上》上映，于和伟在片中饰演了潜伏在敌人内部多年的特工周乙，并凭借该片获得第34届中国电影金鸡奖最佳男主角奖提名。六月二十五日，其参演的革命历史剧《大决战》开播，于和伟在剧中饰演了林彪；七月一日，于和伟参加了庆祝中国共产党成立100周年文艺演出《伟大征程》，与张桐、刘烨、白宇、邓伦、宋轶、杨洋、李现、杨紫等诸多艺人共同合作表演了《破晓》篇章；八月十二日，于和伟特邀出演的都市职场剧《理想之城》开播，他在剧中饰演了睿智果断的企业家赵显坤；十月，成龙电影A计划第五期公布了创投项目评审团及拍摄工作坊导师团阵容，于和伟受邀加盟创投评审团；十月十五日，于和伟加盟了一档原创喜剧竞演综艺《一年一度喜剧大赛》，担任节目嘉宾。二零二二年八月十七日，其参演的纪录片《我的青铜时代 第二季》播出；九月二十三日，其参加的原创喜剧竞演综艺《一年一度喜剧大赛第二季》播出，于和伟在其中担任组委会会长；十一月一日，他加盟了致力于发掘好故事的《金钥匙创投计划》项目；十一月二十九日，其演唱的歌曲《只字不提》正式上线。二零二三年一月十五日，于和伟领衔主演的科幻剧《三体》播出，其在剧中饰演刑警史强，凭借该剧他获得了2023腾讯视频星光大赏“年度电视剧演员”称号；一月二十八日，于和伟获评国家一级演员职称，业界各方纷纷向他表示祝贺；三月三十日，他荣获《剧耀东方·2023电视剧品质盛典》品质榜样剧星奖项；五月二十七日，在北京电影家协会第三次会员代表大会上，于和伟当选为北京电影家协会副主席；六月二十二日，其参加的中央广播电视总台端午特别节目《碧水长歌颂端阳》播出，在节目中他表演了交响诵读《九歌·东皇太一》；九月二十八日，其主演的犯罪警匪电影《坚如磐石》上映，他还亲自献唱了该电影的推广曲《石头决定开花》；十月二十七日，其主演的黑色喜剧电影《二手杰作》上映；十一月，他参加了爱奇艺举办的娱乐活动《2023爱奇艺尖叫之夜》，并荣获“2024观众瞩目男演员奖”。二零二四年一月十八日，由于和伟担任监制并主演的谍战剧《破晓时分》正式开机；二月十日（农历大年初一），其参演的剧情片《第二十条》上映；四月九日，其主演的都市职场剧《城中之城》播出，他在剧中饰演了金融界人士赵辉；六月一日，凭借在谍战片《悬崖之上》中饰演的周乙一角，于和伟获得中国电影导演协会2021年度男演员提名；八月九日，其出演的由徐峥执导的励志题材电影《逆行人生》上映；九月十日，凭借在电视剧《城中之城》和《三体》中的表现，于和伟入围第32届中国电视金鹰奖最佳男主角奖；十月十五日起，由于和伟等约四十位老中青三代文艺工作者接受新华社记者专访的《十年·拾光》系列报道陆续播出；十一月五日，其主演的历史剧《西北岁月》播出，于和伟在剧中饰演了革命先烈刘志丹；十一月二十七日，其领衔主演的刑侦剧《我是刑警》播出，他在剧中饰演了在基层干了四年民警后考上大学，毕业后成为一名刑警的秦川。二零二五年三月十九日，他参加了《2025电视剧品质盛典》活动。二零二五年四月十七日，其出演的电影《森中有林》宣布正式开机；七月十八日，其出演的另一部电影《你行！你上！》上映。八月一日，其参演的电视剧《伟大的长征》在浙江横店举行了开机座谈会。九月，他凭借在《我是刑警》中的表演获得第二届金熊猫奖最佳男主角奖提名。九月三十日，其参演的电视剧《沉默的荣耀》播出。十月二十七日，凭借在电视剧《觉醒年代》中的出色演绎，于和伟获得第一届北京市广播影视春燕奖电视剧优秀男主角奖。十一月二十四日，凭借在《沉默的荣耀》中的表现，他获得第16届澳门国际电视节“金莲花”最佳男主角奖提名。二零二六年二月七日晚八点，其参加的《活力视听·万象同屏——2026中国网络视听年度盛典》节目播出，并在节目中表演了主题短片《征程》。
于和伟的母亲在四十五岁那一年生下了他。他在家中排行第九，前面共有八位哥哥姐姐。其中，年龄最大的姐姐比他年长整整二十四岁。于和伟降临人世时，母亲的奶水并不充足，而当时他的大姐恰好也处于哺乳期，于是，于和伟便由这位长姐亲自哺育长大。不幸的是，在于和伟年仅三岁时，他的父亲便离开了人世。为了养活包括于和伟在内的众多子女，母亲依靠在街头售卖烤地瓜来维持生计，于和伟在每天放学之后，也常常来到母亲身边，陪伴她一同叫卖。可以说，于和伟的成长历程凝聚了母亲与长姐共同的心血与付出，正是在她们双重的关爱与抚育之下，他才得以健康长大。
一九九一年，当时仍在抚顺话剧团工作的于和伟与宋林静相识并逐渐发展为恋人关系。在于和伟的悉心指导和鼓励之下，原本同样热爱表演的宋林静通过自身努力，顺利考入上海戏剧学院的表导演进修班，接受了更为系统专业的艺术训练。一九九六年，两人于同一时期完成学业，并凭借出色的专业能力，共同被南京军区前线话剧团录用，从此开启了他们在同一艺术单位并肩工作的职业生涯。在携手步入婚姻殿堂之后，这对夫妇共同抚育了一个女儿，建立了幸福稳定的家庭。
工作之余，于和伟喜欢看电影、看书，还喜欢去没去过的地方旅行。
《流浪地球·刘慈欣经典作品集 》演播
于和伟在参与拍摄《历史的天空》时，尽管年纪尚轻，却已在片场展现出如同资深戏骨般沉稳且出色的心理素质，其表现远超许多同龄演员。他在《大军师司马懿之军师联盟》中所塑造的曹操形象，被众多观众与评论者认为是最贴近历史原型、最具神韵的一版曹操。外界对于和伟的评价常常集中于“演技精湛”“内心丰盈”以及“相貌相对普通”这几个方面。而所谓“相貌普通”，恰恰印证了他“并非依靠外貌取胜”这一特质，正如艺术界常言，“真正杰出的表演艺术家从来都不凭借颜值立足”。于和伟在荧屏上呈现的形象极为丰富且令人印象深刻，不论他饰演的是主角或配角、正面人物或反派角色、古装题材还是现代故事，都能向观众展示其演技中多样而深刻的层次。他的演艺发展轨迹，在某种程度上与美国演员克林特·伊斯特伍德颇有相似之处——年轻时长期在各类作品中担任配角，直至中年阶段，其扎实的演技才逐渐获得广泛关注与认可；成名初期，他所接演的角色往往带有一定的类型化倾向，但随着其表演功力被越来越多的人所赏识，他所能驾驭的角色范围也自然而然地不断拓宽。在《坚如磐石》中，于和伟生动刻画了黎志田这一复杂人物，而在《二手杰作》里，他又成功塑造了马寅波这一截然不同的形象，两者对比鲜明，充分彰显其角色跨度之大。同样值得称道的是，他在《觉醒年代》中通过细腻演绎，将“陈仲甫先生”这一原本仅存于文字记载的历史人物，变得血肉丰满、立体可感，深深印刻在无数观众的心中。至于在《悬崖之上》中，他所诠释的周乙身上那种正邪交织、难以简单界定的特质，恰恰是于和伟尤为擅长处理的表演范畴。更为可贵的是，他能够通过精准而富有深度的表演方式，实现对生活中某些复杂瞬间的生动再现与艺术化捍卫，从而引发观者的共鸣与思考。